El cultiu cel·lular és una de les eines més importants utilitzades en biologia cel·lular i molecular, proporcionant un excel·lent sistema model per estudiar la fisiologia i la bioquímica normals (per exemple, estudis metabòlics, envelliment), els efectes de fàrmacs i compostos tòxics a les cèl·lules, així com els efectes. de la mutagènesi cel·lular i la carcinogènesi. També s'utilitza en el cribratge i desenvolupament de fàrmacs, i en la producció a gran escala de compostos biològics (per exemple, vacunes, proteïnes terapèutiques). Un avantatge important d'utilitzar el cultiu cel·lular per a qualsevol d'aquestes aplicacions és la consistència i la reproductibilitat dels resultats que es poden obtenir mitjançant l'ús d'un lot de cèl·lules clonals.
cultiu cel·lular
El cultiu cel·lular es refereix a l'eliminació de cèl·lules d'animals o plantes i el seu creixement en un medi artificial favorable. Les cèl·lules es poden eliminar directament del teixit i dissociar-se enzimàticament o mecànicament abans del cultiu, o es poden derivar de línies o soques cel·lulars establertes.
1. Formació primària
El cultiu primari es refereix a l'etapa de cultiu després que les cèl·lules s'han aïllat del teixit i s'han propagat en condicions adequades fins que ocupen tot el substrat disponible (és a dir, arriben a la confluència). En aquesta etapa, les cèl·lules s'han de subcultivar (és a dir, passar) transferint-les a un nou recipient amb un medi de creixement fresc per oferir més espai per al creixement continuat.
2. Línies cel·lulars
Després del primer subcultiu, els cultius primaris s'anomenen línies cel·lulars o subclons. Les línies cel·lulars derivades de cultius primaris tenen una vida útil finita (és a dir, són finites) i quan passen, predominen les cèl·lules amb el potencial de creixement més alt, donant lloc a un grau d'uniformitat genotípica i fenotípica en el sexe de la població.
3. Línies cel·lulars
Una línia cel·lular es converteix en una soca cel·lular si una subpoblació de la línia cel·lular es selecciona activament del cultiu mitjançant la clonació o altres mètodes. Les línies cel·lulars sovint adquireixen canvis genètics addicionals després d'iniciar la línia parental.
4. Línies cel·lulars limitades i línies cel·lulars contínues
Les cèl·lules normals normalment es divideixen només un nombre limitat de vegades abans de perdre la seva capacitat de proliferar, un esdeveniment determinat genèticament anomenat senescència; aquestes línies cel·lulars s'anomenen finites. No obstant això, algunes línies cel·lulars esdevenen immortals mitjançant un procés anomenat transformació, que pot ocórrer espontàniament o ser induït químicament o viralment. Una línia cel·lular finita es converteix en una línia cel·lular contínua quan pateix una transformació i adquireix la capacitat de dividir-se indefinidament.
Les línies cel·lulars cultivades contínuament són propenses a la deriva genètica, les línies cel·lulars finites estan condemnades a l'envelliment, tots els cultius cel·lulars són susceptibles a la contaminació microbiana i la fallada dels equips es pot produir fins i tot als laboratoris més ben gestionats. Com que les línies cel·lulars establertes són un recurs valuós la substitució de les quals és costosa i requereix molt de temps, és essencial criopreservar-les per a l'emmagatzematge a llarg termini.
Un cop s'obté un petit nombre de cèl·lules restants del subcultiu, s'han de congelar com a llavor i protegir-les de l'ús general de laboratori. Les existències de treball es poden preparar i reposar amb existències de llavors congelades. Si s'esgota l'estoc de llavors, llavors el material de treball criopreservat es pot utilitzar com a font per preparar l'estoc de llavors fresques, produint un augment mínim de quantitat des de la congelació inicial.
La millor manera de criopreservar cèl·lules cultivades és en nitrogen líquid, en medi complet, en presència de crioprotectors com el dimetilsulfòxid (DMSO) o el glicerol. Els crioprotectors redueixen el punt de congelació del medi i també redueixen la velocitat de refredament, reduint molt el risc de formació de cristalls de gel, que poden danyar les cèl·lules i provocar la mort cel·lular.
Se sap que el DMSO facilita l'entrada de molècules orgàniques als teixits. Quan es manipulen reactius que contenen sulfòxid de dimetil, s'han d'utilitzar equips i pràctiques adequades per als perills d'aquest material. Eliminar els reactius segons la normativa local.
Fer créixer cèl·lules a partir d'estocs de cèl·lules de treball congelades
Assegureu-vos d'omplir el registre de la banca mòbil
Determineu el nombre de passatges, per exemple, si les cèl·lules anteriors es van congelar i es van descongelar tres vegades, el procés de descongelació seria el quart passatge.
Afegiu medis de creixement (medis mínims, sèrum de vedella i antibiòtics) als flascons T75 etiquetats amb la línia cel·lular, el número de pas i la data.
Col·loqueu el matràs horitzontalment en una incubadora de CO a 37 graus i 5 per cent de CO durant almenys 15 min. Això escalfarà el medi i el portarà al seu pH normal (7.0-7.6)
Descongelar els vials congelats amb línies cel·lulars en un bany maria de 37 graus amb una suau agitació. Per reduir el risc de contaminació, mantingueu la junta tòrica i la tapa per sobre del nivell de l'aigua (2-5 minuts).
Col·loqueu el vial en un armari de seguretat biològica (BSL-2). Per evitar la contaminació, netejar amb etanol al 70 per cent abans d'obrir el vial.
Transferiu el contingut del matràs de cèl·lules congelades a un matràs T75 que conté medi de creixement. Barregeu i agiteu el matràs suaument per distribuir uniformement les cèl·lules per la superfície del matràs.
Incubeu el matràs durant la nit en una incubadora de CO2 a 37 graus amb un 5% de CO2. Deixeu que les cèl·lules s'uneixin durant la nit
canvi de mitjà de creixement
Incubeu el matràs durant 2-4 dies addicionals a 37 graus, 5 per cent de CO2 i vigileu fins que les cèl·lules creixin
Una vegada que les cèl·lules arriben a un 90 per cent de confluència aproximadament, l'estoc de cèl·lules es pot expandir mitjançant un matràs T150.
