1. Recuperació cel·lular
Després d'eliminar les cèl·lules criopreservades del nitrogen líquid, es van descongelar amb agitació constant en un bany d'aigua de 37 graus. Transferiu les cèl·lules descongelades a un tub de centrífuga, afegiu un medi complet DMEM preescalfat a 37 graus (del qual el sèrum fetal boví és d'un 10 per cent), bufeu suaument de manera uniforme, centrifugueu a 500 g durant 2 minuts i descarteu el sobrenedant.
Afegiu el medi complet DMEM per rentar i descartar el sobrenedant. Afegiu el medi complet DMEM, barregeu suaument pipetejant, feu una suspensió cel·lular, inoculeu-lo en una placa/matràs de Petri i feu cultiu en una incubadora cel·lular que conté un 5% de CO2.
2. Pas cel·lular
Quan la densitat cel·lular arriba al 80% ~ 90% (el rendiment prematur és insuficient, les cèl·lules massa tardanes es troben en males condicions, subcultiu en una proporció d'1:2 a 1:10 o més, generalment de 1:3 a 1:5 de generació de cèl·lules, és a dir, a partir de la inoculació cel·lular En el moment de la separació i el recultiu, es va treure el medi complet i es va rentar dues vegades amb PBS 1X.
Afegiu tripsina (nota: la quantitat de solució de digestió és millor per cobrir les cèl·lules, i la temperatura de digestió òptima és de 37 graus. Observeu les cèl·lules al microscopi: observeu les cèl·lules digerides amb un microscopi invertit, si el citoplasma es retreu, les cèl·lules ja no estan connectats entre si. Les rodanxes, que indiquen que les cèl·lules s'han digerit correctament en aquest moment), digerir-les i col·locar-les en una incubadora cel·lular durant uns 2-3 minuts.
Afegiu una quantitat adequada de medi complet DMEM per aturar la tripsinització, transferiu-lo a un tub de centrífuga i centrifugueu a 500 g durant 2 min, descarteu el sobrenedant, afegiu el medi complet DMEM per rentar i descarteu el sobrenedant.
Afegiu el medi complet DMEM, barregeu amb una pipeta suau, pipeteu 10 microlitres per comptar i, a continuació, continueu cultivant en una incubadora cel·lular que conté un 5% de CO2 segons el volum cel·lular requerit.
3. Criopreservació cel·lular
Quan la densitat cel·lular arribi al 80% ~ 90%, traieu el medi complet i renteu-lo 2 vegades amb 1X PBS. Afegiu tripsina per a la digestió i col·loqueu-lo en una incubadora cel·lular durant uns 2-3 min. Afegiu el medi complet DMEM per aturar la digestió de la tripsina, transferiu-lo a un tub de centrífuga i centrifugueu a 500 g durant 2 min, descarteu el sobrenedant, afegiu el medi complet DMEM per rentar i descarteu el sobrenedant. Afegiu 1 ml de solució de congelació (90 per cent de sèrum fetal boví, 10 per cent de DMSO. En general, el contingut de sèrum es pot ajustar entre un 10 per cent i un 90 per cent. L'addició de sèrum a la solució de congelació pot proporcionar nutrients per a les cèl·lules, d'una banda, i pot Proporcioneu substàncies protectores no permeables durant la criopreservació cel·lular, com ara sacarosa, albúmina, etc. per protegir millor les cèl·lules), poseu-la en un tub de criopreservació (hi ha alcohol isopropílic al tub per garantir la velocitat de reducció de la temperatura), poseu-lo immediatament. Congeleu-lo en una nevera de 4 graus durant 30 minuts, després poseu-lo a una nevera de -20 graus durant 30 minuts i, a continuació, poseu-lo a una nevera de -80 graus durant la nit.
Poseu-lo en nitrogen líquid l'endemà, es pot emmagatzemar un mínim de dos anys, i si no el poseu en nitrogen líquid es pot conservar tres mesos.
El principi de la criopreservació i recuperació cel·lular és: congelació i descongelació lenta, que és més propici per mantenir la viabilitat cel·lular. La criopreservació de cèl·lules sense cap agent protector donarà lloc a la producció de cristalls de gel intracel·lulars, que provocaran danys mecànics endògens a les cèl·lules, provocaran canvis en la pressió osmòtica de l'entorn intracel·lular, el pH, els electròlits, etc., i després afavorirà la mort cel·lular.
4. Assumptes que necessiten atenció
(1) Preescalfament de la solució de cultiu: poseu l'ampolla preparada que conté la solució de cultiu, PBS i tripsina en un bany d'aigua de 37 graus per preescalfar;
(2) Utilitzeu alcohol al 75 per cent per netejar el banc de treball ultra net i les mans que s'han irradiat amb raigs ultraviolats;
(3) Col·locació correcta dels instruments usats: assegureu-vos un espai de funcionament suficient, que no només és fàcil d'utilitzar, sinó que també redueix la contaminació;
(4) Enceneu el llum d'alcohol: tingueu en compte que la flama no ha de ser massa petita;
(5) Operació asèptica estricta;
(6) Digestió moderada de cèl·lules adherides: el temps de digestió es veu afectat per molts factors, com ara el tipus de solució de digestió, el temps de preparació i la quantitat afegida al matràs de cultiu. Durant el procés de digestió, s'ha de parar atenció als canvis en la forma de les cèl·lules cultivades. Un cop el citoplasma s'encongeix, si la connexió es deixa anar o hi ha signes de flotació a trossos, la digestió s'ha d'acabar immediatament;
(7) Totes les operacions sobre cel·les de pas han d'estar tan a prop possible de la flama d'una làmpada d'alcohol. El millor és treballar només amb una cel·la alhora, utilitzant un conjunt d'equips per a cada cel·la. evitar la infecció creuada;
(8) La boca de l'ampolla de la cèl·lula passada s'ha d'esterilitzar amb una làmpada d'alcohol cada vegada que s'obre o tanca.
